Jenis‑jenis Mikroskop Fluoresensi

Menghadirkan jendela ke dunia mikroskopik, mikroskop pertama kali ditemukan sekitar tahun 1600 M. Antony van Leeuwenhoek menciptakan lensa kecil berlekukan tinggi dan penyangga mekanis yang menyesuaikan pandangannya, membuka akses ke dunia bakteri, sel darah, protozoa, dan struktur sel tumbuhan. Namun sepanjang sejarah mikroskopi, selalu ada satu pertanyaan: Apa sebenarnya benda aneh yang terlihat melalui lensa? Mikroskopi fluoresensi merupakan serangkaian teknik yang meminimalkan ketidakpastian tersebut – karena ketika cahaya dipancarkan pada sampel, sampel tersebut memancarkan cahaya kembali.

Epifluoresensi

Mikroskop fluoresensi yang paling umum adalah konfigurasi epifluoresensi. Pada mikroskop epifluoresensi, sumber cahaya – biasanya lampu merkuri atau xenon – memancar melalui filter yang memilih rentang panjang gelombang sempit. Cahaya yang difilter kemudian menembus sampel melalui lensa objektif mikroskop. Cahaya masuk diserap oleh fluorofor – pelabel molekuler yang memancarkan cahaya dengan panjang gelombang lebih panjang ketika menyerap cahaya dengan panjang gelombang lebih pendek. Cahaya dari fluorofor, bersama dengan cahaya tersebar dari sumber pencahayaan, kembali ke lensa objektif dan menuju detektor atau mata. Pada jalur tersebut, filter lain memblokir cahaya pencahayaan sehingga hanya cahaya fluoresen dari sampel yang tersisa.

Konfokal

Mikroskop epifluoresensi mengumpulkan cahaya dari seluruh bidang pandang mikroskop. Beberapa cahaya eksitasi diserap sebelum bidang fokus, beberapa di bidang fokus, dan beberapa di luar bidang fokus. Karena mikroskop mengumpulkan semua cahaya itu, citra akan menampilkan gambar tajam di bidang fokus, namun juga cahaya di luar fokus dari wilayah lain. Mikroskop konfokal memperbaiki hal ini dengan memusatkan titik laser pada bidang yang sama dengan bidang fokus mikroskop. Kemudian, sebuah pinhole ditempatkan di depan detektor, memblokir semua cahaya yang tidak berasal dari bidang fokus. Dengan memindai sampel, citra tiga‑dimensi bersih dapat diperoleh.

Multiphoton

Pada mikroskop konfokal, penyelarasan sangat sensitif. Jika titik laser, lensa objektif, optik pengumpul, dan pinhole tidak tepat, kinerja mikroskop menurun. Mikroskop multiphoton mengatasi masalah ini dengan menggunakan panjang gelombang laser yang setengah energi cukup untuk menstimulasi fluorofor di sampel. Fluorofor hanya akan terstimulasi dan memancarkan fluoresen jika cahaya laser cukup terang sehingga dua foton mengenai fluorofor dalam waktu sangat singkat. Hal ini hanya terjadi ketika laser difokuskan pada titik sangat kecil. Jadi, hanya area yang difokuskan yang memancarkan cahaya, menjaga citra bersih karena tidak ada cahaya latar tambahan – sehingga tidak perlu pinhole yang harus diselaraskan.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)

Cara lain untuk mendapatkan citra bersih adalah memastikan cahaya eksitasi tidak menembus jauh ke dalam sampel. Misalnya, sekumpulan neuron ditempatkan dalam tetesan larutan di atas slide kaca, sehingga sebagian neuron menempel pada permukaan kaca. Pada mikroskop TIRF, cahaya diarahkan secara lateral ke slide kaca sehingga tidak benar-benar masuk ke larutan yang menampung sel. Namun sebagian cahaya bocor sedikit ke larutan—hanya sangat dekat dengan permukaan kaca. Hal ini berarti hanya area di dekat permukaan kaca yang memancarkan cahaya. Untuk sel neuron, tempat banyak aktivitas menarik terjadi pada permukaan sel, teknik ini sangat efektif.

Super‑Resolution

Semua mikroskop – termasuk mikroskop fluoresensi – terbatas oleh fisika yang mengatur propagasi cahaya. Salah satu aturan dasar adalah titik cahaya yang difokuskan tidak dapat menjadi lebih kecil dari batas difraksi, sekitar 200 nanometer untuk cahaya tampak. Namun molekul tunggal hanya beberapa nanometer, sehingga banyak fitur menarik berada di bawah batas difraksi. Ilmuwan mengembangkan teknik "super‑resolution" untuk mengatasi batas tersebut. Misalnya, mikroskopi pencahayaan terstruktur (SIM) dan mikroskopi depleksi emisi terstimulus (STED) keduanya merupakan metode mikroskopi fluoresensi yang memperkecil ukuran titik cahaya dengan memperkecil titik cahaya eksitasi.